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Nature綜述文章：Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy
多年來，細(xì)胞生物學(xué)家們一直在嘗試不同的技術(shù)來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，并期望從時(shí)間和空間尺度上理解細(xì)胞行為。然而，這些成像技術(shù)的分辨率很少能夠達(dá)到足以讓人們理解其中化學(xué)反應(yīng)的程度。冷凍電子顯微鏡的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)大分子功能型復(fù)合物的理解，它所能達(dá)到的超高分辨率可以為解釋細(xì)胞運(yùn)作提供更加細(xì)節(jié)的化學(xué)視角。
近日，來自加州大學(xué)伯克利的Eva Nogales和來自歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室的Julia Mahamid在Nature上發(fā)表了題為Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy的綜述。該文章主要探討了冷凍電子顯微鏡(cryo-EM, cryo-electron microscopy) 和冷凍電子斷層掃描 (cryo-ET, cryo-electron tomography) 之間的異同，以及冷凍電鏡的整體發(fā)展和其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。
作者首先對(duì)cryo-EM和cryo-ET的異同進(jìn)行了簡要介紹。Cryo-EM的技術(shù)最早可以追溯到上世紀(jì)五六十年代，隨著幾十年來的不斷改進(jìn)和發(fā)展，cryo-EM成為了解析生物大分子的強(qiáng)大工具。相比于X射線晶體衍射和核磁共振波譜，cryo-EM通常需要更少的樣品材料，并且對(duì)于分子的大小要求也沒有上限。與cryo-EM分離純化樣品分子不同，cryo-ET通常在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境內(nèi)對(duì)分子進(jìn)行原位成像；cryo-EM一般獲得單張分子圖像，而cryo-ET一般獲得不同角度的圖像序列，這些圖像序列可以通過分析獲得三維的分子結(jié)構(gòu)。因此，cryo-EM的研究對(duì)象一般在組成和構(gòu)象變化方面相對(duì)簡單，而cryo-ET的研究對(duì)象相對(duì)來說會(huì)有更高階的組裝模式。
接下來，作者提到，近年來冷凍電鏡的技術(shù)發(fā)展主要體現(xiàn)在探測器的發(fā)展、樣品處理和新型軟件平臺(tái)的開發(fā)：(1) 直接電子探測器 (DED, direct electron detector) 的發(fā)展極大地提高了圖像的對(duì)比度和分辨率，(2) 聚焦離子束切割 (FIB, focused ion beam) 的應(yīng)用與傳統(tǒng)冷凍切片相比，大大減少了對(duì)樣品的干擾，(3) 新型軟件平臺(tái)的創(chuàng)新進(jìn)一步促進(jìn)了cryo-EM的精確數(shù)據(jù)分析。
隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，目前冷凍電鏡可以處理的樣品也逐漸復(fù)雜化。相比于傳統(tǒng)的X射線晶體衍射常用的過表達(dá)蛋白后再純化相比，由于冷凍電鏡需要的樣品量較少，人們可以直接利用CRISPR技術(shù)將內(nèi)源蛋白連上標(biāo)簽后直接純化內(nèi)源蛋白，這樣可以保證最后分析的蛋白最接近體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)。而對(duì)于復(fù)雜的蛋白復(fù)合物，則需要利用cryo-ET并且結(jié)合一系列計(jì)算程序來盡可能確保結(jié)構(gòu)的可信度。另一方面，人們也在放寬對(duì)蛋白提取的純度要求，而轉(zhuǎn)向?qū)?xì)胞裂解物等粗提樣品進(jìn)行粗略的結(jié)構(gòu)分析，這種方法可以有助于復(fù)雜混合物的初始模型構(gòu)建。除了對(duì)樣品進(jìn)行體外分析之外，直接研究細(xì)胞樣品可以提供更偏向真實(shí)生理的信息。冷凍電鏡已經(jīng)在細(xì)胞切片 (FIB) 中有顯著的進(jìn)展，如果研究者想觀察整個(gè)細(xì)胞或組織的話，將FIB切割和掃描電子顯微鏡 (FIB-SEM) 結(jié)合起來，再通過圖像處理可以獲得保真的超分辨電鏡細(xì)胞圖像。
當(dāng)研究者獲得復(fù)雜的細(xì)胞圖像后，他們需要對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子進(jìn)行辨別和區(qū)分。通常有兩種方法可以被用來定性這些分子：(1) 光電聯(lián)合顯微鏡 (CLEM, correlated light and electron microscopy)，通過對(duì)目標(biāo)分子連上熒光分子來區(qū)分目標(biāo)分子和其他結(jié)構(gòu)；(2) 利用分子標(biāo)簽來直接指示目標(biāo)分子的位置，可以是電子顆粒密度的差別也可以是目標(biāo)分子的特殊結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，為了獲得更保真的超微結(jié)構(gòu)，以上這些都離不開更細(xì)致的數(shù)據(jù)分析手段。
Fig 1. 用cryo-ET可視化細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
最后，作者介紹了cryo-EM和cryo-ET的結(jié)合應(yīng)用。由于cryo-ET的結(jié)構(gòu)分辨率通常低于cryo-EM, 而cryo-ET可以對(duì)接近生理狀態(tài)下的細(xì)胞或組織成像，這兩種方法的互相補(bǔ)充可以用于解釋和補(bǔ)充低分辨率的cryo-ET圖像。例如，當(dāng)cryo-ET獲得的細(xì)胞圖像尚未達(dá)到足以讓系統(tǒng)預(yù)測其中復(fù)合物的程度時(shí)，cryo-EM獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)模版可以幫助cryo-ET在原位細(xì)胞中辨別目標(biāo)復(fù)合物。辨別的方法有兩種：(1) 在cryo-ET獲得的3D結(jié)構(gòu)中直接進(jìn)行模版匹配，但由于cryo-ET的分辨率限制，人們也可以 (2) 眾多切片中的單個(gè)高分辨率圖像中進(jìn)行2D模版匹配。但在更多情況下，這兩種方法會(huì)同時(shí)進(jìn)行，相輔相成以確保預(yù)測的準(zhǔn)確度。另外，cryo-ET也可以與細(xì)胞的熒光成像甚至是單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合，為細(xì)胞調(diào)控提供全新的機(jī)制性理解。
提到近來的結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展，便不可不提蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測領(lǐng)域中人工智能 (如AlphaFold或RosettaFold) 的廣泛應(yīng)用。盡管可能有人擔(dān)心實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)生物學(xué)可能將被人工智能代替，但作者表示人工智能預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)可以是實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)生物學(xué)的強(qiáng)大助力。將人工智能的預(yù)測與cryo-EM或cryo-ET獲得的電子密度圖結(jié)合，這樣的實(shí)驗(yàn)流程將會(huì)顯著加速結(jié)構(gòu)模型的建立，并使得解釋捕獲的真實(shí)細(xì)胞內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)的過程更加便捷。
總而言之，細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的互補(bǔ)是人們理解細(xì)胞世界不可或缺的途徑，而冷凍電鏡的發(fā)展將會(huì)使人們對(duì)真實(shí)細(xì)胞活動(dòng)的理解上升到另一個(gè)超微尺度。
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